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广州千寻生物技术有限公司
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广州千寻生物技术有限公司
入驻年限：8 年
- 联系人：
杨经理
- 所在地区：
广东 广州市 黄埔区
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试剂、抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒、技术服务、实验室仪器 / 设备、体外诊断
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公司新闻/正文
千寻生物成功制备 PCV3 单克隆抗体
1100 人阅读发布时间：2019-07-24 15:16
背景
猪圆环病毒 3 型 (porcine circovirus 3,PCV3) 是猪群中流行的一种新型猪圆环病毒。2016 年在美国首次发现并报道新型猪圆环病毒 3 型，该病毒目前在我国流行范围逐渐扩大，对生猪养殖的潜在影响仍不明确。PCV3 壳蛋白 ( capsid，Cap ) 与 PCV1 和 PCV2 的衣壳蛋白差异大，且具有良好抗原性。单克隆抗体技术 (monoclonal antibody technique) 原理是: B 淋巴细胞能够产生抗体， 但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
免疫抗原：自制，来自大肠杆菌表达的上清纯化透析后的 PCV3 Cap 蛋白。
材料：细胞培养板、胎牛血清、DMEM 培养基、酶标板、PEG2000、注射器、弗氏佐剂（完全和不完全）剪刀镊子、BALB/C 小鼠等
1.2 制备步骤
1.2.1 抗原免疫
选择 6-8 周龄 BALB/C 小鼠作为免疫动物，第一次使用完全佛氏佐剂乳化抗原，第二次和第三次不完全佛氏佐剂，每次免疫抗原量 50-100ug。每次免疫间隔两周，最后直接用免疫抗原进行加强免疫。 一般在第二次免疫一周后，尾部采血检测免疫效价。
1.2.2 细胞融合
加强免疫三天后，进行细胞融合。同时在细胞融合之前取小鼠腹腔吞噬细胞作为饲养细胞。
细胞融合具体步骤如下：
1) 将状态良好的 sp2/0 细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到 50 ml 离心管中。
2) 小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入 75% 的酒精中浸泡 5 min。
3) 在平皿中倒入少量无血清的 DMEM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装有 sp2/0 的离心管中，离心 900rpm/min，5 min。
4) 将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的 DMEM 将细胞小心轻柔地吹匀，离心（900rpm/min 5 min）。
6) 将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入 37℃ 温水中，在 45s 分钟内缓慢加入 1 ml 的 PEG，加完后，在温水中静置 1 min。然后 2 min 内缓慢加入 2 ml 的无血清的 DMEM，接着 2 min 内缓慢加入 8 ml 无血清的 DMEM。离心 900rpm/min，5 min。
7) 倒掉上清，加入 40 ml 的 20% 血清 DMEM，小心的将细胞吹匀，每孔 100ul 加入事先制备的饲养细胞的 96 孔培养板中，放入 37 度培养箱中培养。
1.2.3 亚克隆 采用有限稀释法进行亚克隆。
1.2.4 腹水制备 提前一周腹腔注射 0.5 ml 石蜡油/只。每只小鼠注射约 1*10^6 个细胞。每天观察小鼠状态，约 9 天后开始每天收集腹水。
1.2.5 腹水效价测定
3 实验结果
3.1 PCV3 Cap 蛋白制备及纯化结果
图 1 PCV3 Cap 蛋白纯化 SDS-PAGE 分析结果
3.1 二免后免疫效价测定
断尾采血。三只小鼠分别用红、黑、蓝三种颜色记号笔标记；判定标准就是 P/N 值大于等于 2.1 时对应的最大血清稀释度。ELISA 结果显示，其中两只小鼠免疫效价均为 12800，另一只 6400。红和黑标记的小鼠抗体效价均超过 10000，达到了细胞融合条件。
3.2 初筛结果
用 PCV3 Cap 蛋白包被板，ELISA 法筛选阳性细胞株近 40 株。分别冻存细胞，并选取 16 株做亚克隆。
3.3 制备腹水
根据小鼠及细胞情况，制备了其中 9 株腹水。分别是 C11C、C9C、C9E、 D9C、 C7E、C6D 、A8F 、B7D、C6E。重新复苏细胞株，ELISA 鉴定为阳性。
3.4 腹水效价检测结果
其中 A8F/B7D/C11C 效价都在 1:64000 以上，C9E 1:32000，C6E 1:6000，其余为在 1:1000。如下表所示。判定标准为 P/N 比值大于 2.1 为阳性。
4. 结论：
采用纯化的 PCV3 Cap 蛋白免疫雌性 BALB/c 小鼠，经细胞融合和亚克隆获得了 16 株能够稳定分泌 IgG 型杂交瘤细胞株；后续经过反向筛选鉴定此 16 株单抗与 His 标签不反应。目前，兽医科研人才尝试分离 PCV3 病毒，此 16 株单抗具有通过免疫组化和间接免疫荧光鉴定 PCV3 的潜在应用价值。后续我们将继续鉴定此 16 株单抗是否具有双抗夹心的能力，探索建立双抗夹心法 ELISA 或胶体金。