千寻生物成功制备PCV3单克隆抗体

背景

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)是猪群中流行的一种新型猪圆环病毒。2016 年在美国首次发现并报道新型猪圆环病毒3型，该病毒目前在我国流行范围逐渐扩大，对生猪养殖的潜在影响仍不明确。PCV3壳蛋白 ( capsid，Cap ) 与PCV1和PCV2的衣壳蛋白差异大，且具有良好抗原性。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique) 原理是: B淋巴细胞能够产生抗体， 但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。

1. 材料与方法

1.1 实验材料

免疫抗原：自制，来自大肠杆菌表达的上清纯化透析后的PCV3 Cap蛋白。

材料：细胞培养板、胎牛血清、DMEM培养基、酶标板、PEG2000、注射器、弗氏佐剂（完全和不完全）剪刀镊子、BALB/C小鼠等

1.2 制备步骤

1.2.1 抗原免疫

     选择6-8周龄BALB/C小鼠作为免疫动物，第一次使用完全佛氏佐剂乳化抗原，第二次和第三次不完全佛氏佐剂，每次免疫抗原量50-100ug。每次免疫间隔两周，最后直接用免疫抗原进行加强免疫。 一般在第二次免疫一周后，尾部采血检测免疫效价。

1.2.2 细胞融合

     加强免疫三天后，进行细胞融合。同时在细胞融合之前取小鼠腹腔吞噬细胞作为饲养细胞。

细胞融合具体步骤如下：

1) 将状态良好的 sp2/0 细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到 50ml 离心管中。

2) 小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入 75％的酒精中浸泡 5min。

3) 在平皿中倒入少量无血清的 DMEM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装有sp2/0 的离心管中，离心 900rpm/min，5min。

4) 将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的 DMEM 将细胞小心轻柔地吹匀，离心（900rpm/min 5min）。

6) 将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入 37℃温水中，在45s 分钟内缓慢加入 1ml 的 PEG，加完后，在温水中静置 1min。然后 2min 内缓慢加入 2ml 的无血清的 DMEM，接着 2min 内缓慢加入 8ml 无血清的DMEM。离心 900rpm/min，5min。

7) 倒掉上清，加入 40ml 的20%血清DMEM，小心的将细胞吹匀，每孔100ul加入事先制备的饲养细胞的96孔培养板中，放入37度培养箱中培养。

1.2.3 亚克隆 采用有限稀释法进行亚克隆。

1.2.4 腹水制备  提前一周腹腔注射0.5ml石蜡油/只。每只小鼠注射约1*10^6个细胞。每天观察小鼠状态，约9天后开始每天收集腹水。

1.2.5  腹水效价测定  

3  实验结果

3.1 PCV3 Cap蛋白制备及纯化结果

     

 

图1 PCV3 Cap蛋白纯化SDS-PAGE分析结果

3.1 二免后免疫效价测定

断尾采血。三只小鼠分别用红、黑、蓝三种颜色记号笔标记；判定标准就是P/N值大于等于2.1时对应的最大血清稀释度。ELISA结果显示，其中两只小鼠免疫效价均为12800，另一只6400。红和黑标记的小鼠抗体效价均超过10000，达到了细胞融合条件。  

3.2初筛结果

   用PCV3 Cap蛋白包被板，ELISA法筛选阳性细胞株近40株。分别冻存细胞，并选取16株做亚克隆。

3.3 制备腹水

   根据小鼠及细胞情况，制备了其中9株腹水。分别是C11C、C9C、C9E、 D9C、 C7E、C6D 、A8F 、B7D、C6E。重新复苏细胞株，ELISA鉴定为阳性。

3.4  腹水效价检测结果

其中A8F/B7D/C11C效价都在1:64000以上，C9E  1:32000，C6E 1:6000，其余为在1:1000。如下表所示。判定标准为P/N比值大于2.1为阳性（缺少D9C）。

                  不同稀释度下的P/N值

	编号
稀释倍数	C7E	A8F	C6E	C9C	C11C	C9E	C6D	B7D	小鼠阳性血清
1000	2.18±0.06	42.76±1.49	8.1±0.04	2.31±0.07	39.43±2.46	22.49±0.46	2.38±0.09	34.85±2.32	55.16±1.28
2000	1.81±0.12	33.57±0.5	4.82±0.09	1.77±0.05	39.91±1.22	15.37±0.21	1.69±0.03	27.61±1.92	51.89±3.21
4000	1.41±0.05	24.34±0.75	3.12±0.04	1.55±0.04	35.91±0.56	9.21±0.44	1.25±0.06	20.76±1.2	50.06±1.92
8000	1.29±0.06	15.99±0.38	2.27±0.05	1.2±0.07	31.73±1.67	5.64±0.29	1.08±0.13	15.1±0.64	45.59±2.57
16000	1.24±0.01	11.43±0.62	1.73±0.08	1.15±0.04	25.37±0.71	3.75±0.09	1.07±0.07	9.9±0.51	41.24±2.11
32000	1.31±0.15	7.54±0.37	1.5±0.09	1.03±0.06	18.69±1.2	2.54±0.08	1.03±0.03	6.37±0.19	35.46±2.35
64000	1.13±0.08	4.6±0.12	1.15±0.1	0.99±0.11	13.26±0.5	1.74±0.18	0.88±0.04	3.76±0.03	27.95±0.95

结论： 

  采用纯化的PCV3 Cap蛋白免疫雌性BALB/c 小鼠，经细胞融合和亚克隆获得了16株能够稳定分泌IgG 型杂交瘤细胞株；后续经过反向筛选鉴定此16株单抗与His标签不反应。目前，兽医科研人才尝试分离PCV3病毒，此16株单抗具有通过免疫组化和间接免疫荧光鉴定PCV3的潜在应用价值。后续我们将继续鉴定此16株单抗是否具有双抗夹心的能力，探索建立双抗夹心法ELISA或胶体金。