千寻生物成功制备塞内加谷病毒单克隆抗体

658 人阅读发布时间：2019-06-11 11:10

背景
塞内加谷病毒（Senecavirus A,SVA）是一种新发现的能引起猪水泡性疾病的一种小RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科，塞内加谷病毒属。其临床症状与口蹄疫、猪水泡病、水疱性口炎等病毒性疾病相似，所以临床诊断难度大。SVA最早是在细胞培养物中偶然发现，2014年在巴西爆发，导致大量仔猪死亡。2015年中国也首次分离到SVA中国毒株，目前国内对SVA的认识尚浅，为预防大规模爆发对养殖业的影响，有必要加强感染的临床诊断及疫苗研制。
SVA VP1蛋白是诱导中和抗体的主要成分，是抗原变异的关键结构蛋白，其核苷酸易发生变异，具有重要的抗原位点。

材料与方法
1. 实验材料

免疫抗原：自制，来自大肠杆菌表达的上清纯化透析后的SVV VP1蛋白。
材料：细胞培养板、胎牛血清、DMEM培养基、酶标板、PEG2000、注射器、弗氏佐剂（完全和不完全）剪刀镊子、BALB/C小鼠等。

1. 制备步骤
  1. 抗原免疫

选择6-8周龄BALB/C小鼠作为免疫动物，第一次使用完全佛氏佐剂乳化抗原，第二次和第三次不完全佛氏佐剂，每次免疫抗原量50-100ug。每次免疫间隔两至三周，最后直接用免疫抗原进行加强免疫。一般在第二次免疫一周后，尾部采血检测免疫效价。

1. 1. 细胞融合

加强免疫三天后，进行细胞融合。同时在细胞融合之前取小鼠腹腔吞噬细胞作为饲养细胞。

1. 1. 亚克隆采用有限稀释法进行亚克隆。
  2. 细胞间接免疫荧光实验
  3. 腹水效价测定分别将腹水倍比稀释，利用ELISA法检测效价。

3 实验结果
3.1 SVA VP1蛋白制备及纯化结果
新闻图片1

图1 VP1蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析
M: 蛋白质分子质量标准；1：纯化的VP1蛋白；2：细菌裂解沉淀；3：细菌裂解上清；4: PET32a重组质粒诱导表达产物；5：空载体诱导表达产物；6： PET32a重组质粒未诱导表达产物；7：空载体未诱导表达产物
3.2 初筛结果
通过间接ELISA法筛选出33株阳性细胞孔，通过亚克隆后，选取10株做腹水，经过细胞间接荧光实验验证，有4株IFA 阳性。
3.3   IFA鉴定
     通过IFA荧光鉴定，以下4株（12#，16#，15#，29#）单抗能够与SVV结合，产生荧光阳性。（阳性对照为小鼠免疫后阳性血清）
      新闻图片2

3.4 腹水效价检测结果
通过间接ELISA法检测，12#腹水效价400,15#腹水效价800,16#腹水效价1600,29#腹水效价3200。
表1：腹水不同稀释倍数下的P/N值表

	腹水编号
稀释度	12#	15#	16#	29#
100	4.1	5.4	7.1	5.3
200	3.1	2.9	2.9	3.3
400	2.1	2.3	2.1	2.8
800	2.0	2.1	2.2	2.5
1600	1.7	1.6	2.4	2.4
3200	1.5	1.5	1.4	2.2
6400	1.2	1.6	1.4	1.9
12800	1.8	1.2	1.2	1.6

结论：通过大肠杆菌系统表达重组SVA VP1蛋白并纯化，以VP1蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠，获得了4株能胜任间接免疫荧光实验的单抗细胞株。希望这4株单抗能够为SVA相关的科研人员和诊断试剂生产企业提供一点帮助，助力SVA防控。

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