1. 背景 

塞内加谷病毒（Senecavirus A,SVA）是一种新发现的能引起猪水泡性疾病的一种小 RNA 病毒，属于小核糖核酸病毒科，塞内加谷病毒属。其临床症状与口蹄疫、猪水泡病、水疱性口炎等病毒性疾病相似，所以临床诊断难度大。SVA 最早是在细胞培养物中偶然发现，2014 年在巴西爆发，导致大量仔猪死亡。2015 年中国也首次分离到 SVA 中国毒株，目前国内对 SVA 的认识尚浅，为预防大规模爆发对养殖业的影响，有必要加强感染的临床诊断及疫苗研制。

SVA VP1 蛋白是诱导中和抗体的主要成分，是抗原变异的关键结构蛋白，其核苷酸易发生变异，具有重要的抗原位点。


2. 材料与方法

2.1 实验材料

免疫抗原：自制，来自大肠杆菌表达的上清纯化透析后的 SVV VP1 蛋白。

材料：细胞培养板、胎牛血清、DMEM 培养基、酶标板、PEG2000、注射器、弗氏佐剂（完全和不完全）剪刀镊子、BALB/C 小鼠等。

2.2 制备步骤

2.2.1 抗原免疫

选择 6-8 周龄 BALB/C 小鼠作为免疫动物，第一次使用完全佛氏佐剂乳化抗原，第二次和第三次不完全佛氏佐剂，每次免疫抗原量 50-100ug。每次免疫间隔两至三周，最后直接用免疫抗原进行加强免疫。 一般在第二次免疫一周后，尾部采血检测免疫效价。

2.2.2 细胞融合

加强免疫三天后，进行细胞融合。同时在细胞融合之前取小鼠腹腔吞噬细胞作为饲养细胞。

a)  亚克隆  采用有限稀释法进行亚克隆。

b)  细胞间接免疫荧光实验   

c)  腹水效价测定   分别将腹水倍比稀释，利用 ELISA 法检测效价。

2.3 实验结果 

2.3.1  SVA VP1 蛋白制备及纯化结果 


图 1 VP1 蛋白纯化产物的 SDS-PAGE 分析 
M: 蛋白质分子质量标准；1：纯化的 VP1 蛋白；2：细菌裂解沉淀；3：细菌裂解上清；4: PET32a 重组质粒诱导表达产物；5：空载体诱导表达产物；6： PET32a 重组质粒未诱导表达产物；7：空载体未诱导表达产物 

2.3.2 初筛结果 

通过间接 ELISA 法筛选出 33 株阳性细胞孔，通过亚克隆后，选取 10 株做腹水，经过细胞间接荧光实验验证，有 4 株 IFA 阳性。

2.3.3  IFA 鉴定 

通过 IFA 荧光鉴定，以下 4 株（12#，16#，15#，29#）单抗能够与 SVV 结合，产生荧光阳性。（阳性对照为小鼠免疫后阳性血清）



2.3.4  腹水效价检测结果 

通过间接 ELISA 法检测，12#腹水效价 400,15#腹水效价 800,16#腹水效价 1600,29#腹水效价 3200。




3. 结论

通过大肠杆菌系统表达重组 SVA VP1 蛋白并纯化，以 VP1 蛋白为抗原免疫 BALB/C 小鼠，获得了 4 株能胜任间接免疫荧光实验的单抗细胞株。希望这 4 株单抗能够为 SVA 相关的科研人员和诊断试剂生产企业提供一点帮助，助力 SVA 防控。